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摘要
大腸桿菌群(coliform)多存在於溫血動物之糞便、人類活動之場所及有糞便污染的地方，常被作為食品 被糞便汙染之指標。近年來 ，ISO 機構提出以腸桿菌科傾注平板檢驗方法取代大部分食品的大腸桿菌群MPN 法作為衛生指標菌，而台灣衛福部食品藥物管理署亦於 2018 年 8 月公告腸桿菌科檢驗方法之草案。 為了評估新公告之草案與其它兩種大腸桿菌群檢驗方法(臺灣之大腸桿菌群 MPN 法及中國大陸國標大腸 桿菌群直接平板法)之效能，本研究利用 15 件手搖飲料檢體及 2 件標準菌種的對照組進行三種方法檢驗結 果的比較。利用不同稀釋濃度的檢液及培養基等進行評估，培養 24 小時後 ，計數及接續進一步鑑定。結果 發現其中有5個檢體為未檢出和2件陽性飲料檢體MPN法超過1,100 MPN/g，因此，不能作為比較之用 ， 本研究以介於未檢出及大量檢出中間的 8 件陽性檢體進行生長的菌數多寡比較，結果指出以新公告腸桿菌 科草案所獲得的腸桿菌科菌數比其它兩種大腸桿菌群方法所獲得的菌數高，此說明衛福部新公告方法作為 衛生指標菌有其意義及重要性 。另外 ，本研究發現市售手搖飲料大腸桿菌群或腸桿菌科衛生指標菌檢測不 合格率高達66.7% (10/15)，值得衛生主管單位作為稽核及加強從業人員衛生教育的參考。
關鍵字:腸桿菌科(Enterobacteriaceae) 、大腸桿菌群、MPN 法、衛生指標菌
前言
腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是指在適 當條件下發酵葡萄糖產酸、氧化酶陰性的需 氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。細菌 學上將腸桿菌科的細菌分為 20 個菌屬 ，包括Escherichia(埃希氏菌) 、Shigella(志賀氏 菌)、Salmonella(沙門氏菌)、Citrobacter(檸檬酸桿菌) 、Klebsiella(克雷伯氏菌)、Enterobacter(腸桿菌) 、Serratia(沙雷氏
菌)、Hafnia(哈夫尼氏菌) 、Edwardsiella(愛德華氏菌) 、Providencia(普羅威登斯 氏菌)、Proteus(變形桿菌)、Morganella(摩根氏菌)、Yersinia(耶爾森氏菌)等[1]。
大腸桿菌群(coliform)並非指特定菌株， 而是指一群在人體腸胃道內有相同生理活性 的菌群。在細菌學上的意義為一群好氧或兼 性厭氧且能在 37°C下分解乳糖產酸產氣的革 蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要包括檸檬酸桿菌(Citrobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、腸 桿菌(Enterobacter) 、大腸桿菌(Escherichiacoli);但不包括非乳糖發酵型的食品病原菌 (例如:沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌 等)，因此不夠明確表示出食品加工後的衛 生狀況[1]。
長久以來，食品衛生中以指標菌作為食 品安全及品質的標準 。當無法檢測食品中每 種有害微生物時，只針對某些特定指標菌作 為是否合乎衛生要求之指標，如:總生菌數、 大腸桿菌群、大腸桿菌。目前台灣檢驗大腸 桿菌群使用的 MPN 法只是估計值 ，並不是很 精確，且大腸桿菌群只能檢測乳糖發酵型食 品病原菌。
2018 年 8 月衛福部提出腸桿菌科的檢驗 方法草案，因為腸桿菌科包括所有能夠發酵 葡萄糖產酸 、氧化酶陰性的革蘭氏陰性無芽 孢桿菌，涵蓋的種類較大腸桿菌群為多，也 包括了病原菌 ，除了大腸桿菌群的乳糖發酵 型細菌，還包含許多非乳糖發酵型細菌(如 變形桿菌及其它相近菌種) ，能夠確切呈現 較實際的汙染程度[1]。
本研究主要目的是將台灣腸桿菌科直接 平板檢驗方法草案與大腸桿菌群 MPN 法 、大 陸國標大腸桿菌群直接平板檢驗方法做比較 ， 想瞭解市售飲料中大腸桿菌群及腸桿菌科的 偵測以不同方法及培養基進行，產生之數據 會有何差異 。
材料及方法
試驗材料
本研究主要是初步評估 2018 年 8 月 1 號衛 生局福利部食品藥物管理署訂定之腸桿菌科 檢驗方法草案與原先公告的大腸桿菌群 MPN法、大陸國標大腸桿菌群檢驗方法這三者的 效能差異，共檢測 15 件檢體，均為手搖飲料 。
試劑與耗材
根據台灣公告大腸桿菌群 MPN 法、腸桿菌科直接平板檢驗 、大陸國標大腸桿菌群直 接平板檢驗所需的稀釋液(磷酸緩衝溶液、 緩衝蛋白腖水)、選擇性增菌液(Lauryl sulfate tryptose broth 、brilliant green lactose bile broth) 、選擇性分離培養基(VRBGA、VRBA)及滋養培養基(Blood agar plate，BAP)皆購 自啟新生物科技有限公司(新北市，台灣)。 培養基均經無菌性試驗與培養基效能(即滋 養性、增菌性、選擇性與區分性相關效能) 試驗確認品質。
菌株製備
本研究的品管對照菌株為 Enterobacter cloacae ATCC 13047 及 Escherichia coliATCC 25922 作為培養基效能測試的對照組 菌種，將兩菌株接種至 BAP 培養於 35±1°C 一般培養箱中 18~24 小時，之後接種第二次 達到生化/生理特性的活化效果。
菌液製備
將欲得到預估菌量的菌液滴至無菌培養 皿進行傾注平板法作為基準，首先以接種環 挑取活化後之菌株於 0.85%之 5 mL TSB 中 調整菌液濃度至相當 McFarland no. 0.5 標準 液，以分光光度計測量 Enterobacter cloacae及 Escherichia coli 之 OD 值分別為 0.082 及0.088 ，再從菌液使用吸管取 1 mL 菌液加入9 mL 滅菌飲料進行序列稀釋至 106 倍，隨後 進行效能比較試驗 。
台灣公告之大腸桿菌群 MPN 法[2]:此方 法是檢體經序列稀釋後，以三階三管進行培 養 ，並進行 MPN 計數 。操作時 ，秤取 50 g飲料檢體加入 450 mL 磷酸緩衝溶液(Phosphate buffer，pH 7.2)，即為 10 倍稀釋液。再以 90 mL 磷酸緩衝溶液進行 10 倍序列稀釋後，分 別吸取 1 mL 稀釋液(1:10，1:100 及 1:1,000)注入裝有發酵管的 Lauryl sulfate tryptose broth (LST)各三支 ，在 35°C一般培養箱培養24~48 小時後，若發酵管內有氣體產生則為 大腸桿菌群推定陽性。自陽性試管內取一接 種環液體至 brilliant green lactose bile broth (BGLB)，在 35°C一般培養箱培養 24~48 小 時後 ，產氣者為大腸桿菌群陽性 ，計算 BGLB陽性反應試管數 ，查 MPN 表，最後計算大腸 桿菌群之最確數，以 MPN/g 表示。
台灣公告腸桿菌科直接平板檢驗法[3]: 檢體經系列稀釋後，以傾注選擇性平板培養 基培養及計數之方法。秤取 50 g 飲料檢體加 入 450 mL 緩衝蛋白腖水(BPW) ，即為 10 倍 稀釋液 。再以 90 mL 緩衝蛋白腖水進行 10 倍 序列稀釋後。取 1 mL 稀釋檢液至無菌培養 皿 ，二重複，再倒入 10~15 mL 的 violet red bile glucose agar (VRBGA)，以 8 字方式搖 勻，將培養基與檢液充分混勻，待培養基凝 固後，再加 3~4 mL VRBGA 覆蓋平板表層， 防止蔓延生長並使菌落特徵更為明顯。然後 將凝固後的平板置於 37°C一般培養箱 ，倒置 培養 24±2 小時後，計數平板上菌數量(計數 介於 15~150 菌落數)。典型菌落為有或無沉 澱環的粉紅色至紅色或紫色菌落。從 VRBGA平板上至少挑取 5 個(少於 5 個全選)典型 菌落進行確認。其方式為分別將所挑選的每 一個菌落，四區劃線於 BAP，置於 37°C一般 培養箱，倒置培養 24±2 小時後，挑取單一菌 落進行 MALDI-TOF MS 的鑑定。
大陸國標大腸桿菌群直接平板檢驗法[4]: 檢體經系列稀釋後，以傾注選擇性平板培養 基培養及計數之方法。取 50 g 飲料檢體，其 無菌稀釋液及稀釋方法與台灣 MPN 法相同 。 取 1 mL 稀釋檢液至無菌培養皿 ，二重複， 再 倒 入 15~20 mL 的 violet red bile agar (VRBA) ，8 字搖勻，將培養基與檢液充分混 勻，待培養基凝固後，再加 3~4 mL VRBA覆蓋平板表層。然後將凝固後的平板置於36±1°C一般培養箱 ，倒置培養 18~24 小時 後 ，計數平板上菌數量(計數介於 15~150 菌落數)。典型菌落為紫紅色 ，菌落周圍有紅 色膽鹽沉澱環 ，菌落直徑為 0.5 mm 或更大 。 從 VRBA 平板上挑取 10 個不同類型的典型 和可疑菌落 ，少於 10 個菌落時，則挑取全部 典型和可疑菌落。分別移種於 BGLB，在36±1°C的一般培養箱培養 24~48 小時後 ，產 氣者為大腸桿菌群陽性。
MALDI-TOF MS 鑑定腸桿菌科[5]
plate)的一個凹槽滴加 Bruker 細菌測試標準(bacterial test standard)， 風 乾 後 即 可 進 行Microflex LT 儀器校正，然後分別以滅菌牙 籤挑取適量的預檢測菌落到 MSP 96 靶板的 各個測試凹槽上 ，待乾燥 ，將測試凹槽以 1
L 的 70% formic acid(甲酸)(Sigma, USA)覆蓋後，乾燥 ，最後滴加 1
L 的標準溶液
結果
檢測 15 件飲料檢體及兩組對照組進行台 灣公告大腸桿菌群 MPN 法、腸桿菌科直接平 板檢驗方法與大陸國標大腸桿菌群直接平板 檢驗方法後，若呈陽性 ，則取 15-150 CFU 計 數範圍內之培養基進行計數(圖 1)，並分 別取 5 個或 10 個可疑菌落進行純化，再進行MALDI-TOF MS確證，最後代入公式計算 。15 件檢體中扣除三種方法均未檢出的 5件檢體以及 2 件 MPN 法超過 1,100 MPN/g,因此 ，不能作為比較之用，本研究以介於未 檢出及大量檢出中間的 8 件陽性檢體進行 3種方法測試結果的比較，結果如表 1 。又本 研究另外發現手搖飲料以三種方法檢驗之衛
生不合格率均高達 66.7%(10/15)
討論
檢體的成分不同，可能會影響方法之效 能，因此需要額外做一組對照組。標準菌株 之預估菌量為 1.5×108 CFU/mL，在三種方 法下檢測到的菌量皆約為 107 CFU/mL ，由 此可看出無明顯差異，而 MPN 法中無法得到 準確菌數。本研究所使用的檢體 11~15 皆無 陽性產氣管及菌落生長，因此取無菌之飲料後作為調菌基質 ，進行對照組之確認。檢體1 、檢體 3、檢體 4 及檢體 8 在大陸國標大腸 桿菌群、台灣腸桿菌科之方法中菌數皆落在102 CFU/g，但在 MPN 法只偵測到 43 MPN/g(95%信賴區間為 9~180 CFU)，由此可看 出 MPN 法檢出的菌數比其他兩種方法低 。另 外 ，檢體 2、檢體 5、檢體 6 及檢體 7 之檢出 菌數以台灣腸桿菌科方法最高 ，其次為大陸 國標大腸桿菌群，而以 MPN 法最低。
台灣腸桿菌科檢驗方法偵測之菌數最多， 是因腸桿菌科包含 42 個菌屬 ，涵蓋範圍大， 其中就包含衛生指標菌及常見病原菌 ，例如 大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、阪崎腸桿 菌等。此方法中所使用的 VRBGA(結晶紫 中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂)組成分中含有乳糖 和葡萄糖，因此，VRBGA 適用於所有腸桿 菌科菌種的分離。大陸大腸桿菌群檢驗方法 所使用的 VRBA(結晶紫中性紅膽鹽瓊脂) 與 VRBGA 之組成分有些微差異，VRBA 僅 含有乳糖，適用於乳糖發酵型細菌的分離。 因此此方法能偵測到之菌數會比腸桿菌科還 要少 。
最後 ，MPN 法屬於半定量法，透過大腸 桿菌群之生理功能判斷此菌的存在及數量 ， 判讀後，查 MPN 表，推算出來的數據僅為統 計估計值，有其信賴區間 ，但無法得到準確 之數據 。若要以 MPN 法與直接平板法做比 較，以直接平板法所獲得的菌數較高 ，且在24 小時內可獲得結果。
根據 MALDI-TOF MS 確證之結果 ，發 現VRBA中可生長之菌種包含Rahnella aqua- tilis、Pantoea agglomerans、Enterobacter asburiae 、Klebsiella oxytoca 、Klebsiella pneumoniae、Serratia plymuthica、Erwinia persicina、Ewingella americana、Bacillus clausii，其中 Bacillus clausii 屬於芽孢桿菌 科，主要是因為其可利用乳糖發酵產生乳酸 ， 因此可在 VRBA 生長 。而 VRBGA 除了上述 菌種以外，還鑑定出葡萄糖非發酵菌中的Achromobacter xylosoxidans ，此可能是因為 此菌可氧化利用葡萄糖之故。由此可知，VRBA 及 VRBGA 除了大腸桿菌群及腸桿菌 科可生長外 ，也可能會有其他菌種生長 。
中國國標中腸桿菌科檢驗方法可分成MPN 法及傾注平板法 ，ISO 另外公告食品之 腸桿菌科檢驗法以直接平板法取代 MPN 法 後 ，許多國家隨後跟進訂定相關公告方法，台灣於 2018 年 8 月也提出草案 。各國皆以直 接平板法為主要之食品衛生指標菌 ，但可能 是因為 MPN 法過程繁瑣，從採樣至最終報告 所需時間較長，因此台灣之腸桿菌科檢驗方 法僅公告直接平板法，而沒有 MPN 法 。
本研究發現手搖飲料以三種衛生指標菌 檢測方法檢驗的結果，衛生不合格率高達66.7%(10/15)，然而，其中 60%(6/10) 的大腸桿菌群菌數低於 100 MPN/g(mL)，若 以 Petrifilm E. coli/coliform count plate 檢 測，將僅能檢測 22.7%[6]。
綜合上述結果，15 件檢體中以台灣衛福 部公告腸桿菌科的直接平板法效能最佳(獲 得菌數最高)，因為培養基之成分可供較多 革蘭氏陰性菌 、葡萄糖發酵型細菌生長 ，而 大陸國標大腸桿菌群之直接平板法所使用的 培養基成分僅限於乳糖發酵菌的生長，因此 生長的菌種較少 ，最後 MPN 法若是大腸桿菌 群菌量過多的情況下，將無法準確得知其菌 量 。
參考文獻
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行政院衛生福利部食品藥物署。食品微生物之檢驗
方法–腸桿菌科之檢驗。衛授食字第 1071901433 號 預告訂定。2018 。行政院衛生福利部食品藥物管理 署，台灣。
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黃品瑜 ，陳羿樺，蔡文城 。基質輔助雷射脫附遊離 飛行質譜儀(MALDI-TOF MS)對退伍軍人菌的鑑定效 能 ，檢驗及品保雜誌。2017; 6:51~62。
張玉芝，蔡岳廷 ，林冠慧 ，蔡文城。以 CNS 方法與Petrifilm 偵測食品中 Coliform(大腸桿菌群)及 Es- cherichia coli(大腸桿菌)之比較 。檢驗及品保雜 誌。2012; 1:87~91 。
選取 MSP 96 凹槽靶板(96-wells target
L saturated
- cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix溶液〔配製方法為取 0.0025 g 的 -cyano-4- hydroxycinnamic (Sigma, USA)，加至 250
內含 50% acetonitrile (J. T. Baker, USA) ，47.5%純水及 2.5% trifluoracetic acid] (Sigma, USA) ，配製及保存時需避光〕 覆蓋，乾燥後，便可置入 MALDI-TOF MS的儀器中開始偵測。產生質譜菌屬及菌種個 別專一性高峰(peaks)能提供獨一無二型式圖 譜(profile) ，質譜分析是一種測量離子荷質 比(電荷-質量比)的分析方法 ，電腦的軟體(software)將產生的質譜與軟體中參考質譜的 資料庫相比較，得到關係最近微生物的名單， 依分數(score)大小排序(numeric rankings)。MALDI-TOF MS 檢驗結果，每個樣品會提 供 10 個高分鑑定結果，鑑定結果第一名分數 大於 2.0，且第一名等於第二名，則鑑定可信 程度至「菌種」。鑑定出的分數小於 2.0 ，但 高於 1.7 ，則鑑定可信程度至「菌屬」 ，以此 標準分析鑑定結果。
