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前言
B 群鏈球菌(Group B Streptococcus； GBS；Streptococcus agalactiae)為一種革蘭 氏陽性球菌，常棲息於生殖泌尿道與腸胃道
的共生菌 ，通常帶菌者不會出現症狀，但因 新生兒抵抗力較低 ，容易透過母親垂直感染 ， 是造成新生兒敗血症之最大殺手；既使治癒 後依然會有約30%帶有神經系統的後遺症， 例如：聽力或是視力受損 、學習與運動障礙 或是腦性麻痺等[1-2]。
目前衛福部建議懷孕35-37週孕婦應進 行篩檢 ，透過棉拭採檢陰道及直腸末端後， 接著把拭子接種在 Carrot broth、Lim broth或 Trans-Vag broth 中，若種在 Carrot broth 中於35-37℃的 CO2 培養箱培養18-24小時 後 ，發現有胡蘿蔔色即可發出 GBS 陽性報 告，若無則再移種至其他平板培養基 ；而種 在Lim broth或Trans-Vag broth中於35-37℃ 的 CO2 培養箱培養18-24小時後，全部需劃 種於平板培養基 ，並再於35-37℃的 CO2 培 養箱培養18-24小時後 ，若有疑似菌落再進 行鑑定試驗後才可發出報告[3]。 檢測GBS的流程中必需將檢體增菌後再 移種，目的為增加GBS的分離率[4] ，而在台 灣[2-4]及國外的研究[5]中有提及GBS的增菌培 養液可選用Carrot broth, Lim broth及 TransVag broth，而移種的培養基可選用 BAP 、 CNA、CHROMagar StreptB及GBS DetectTM， 而在台灣則有新設計的分離培養基-CMPTM Carrot agar及 / GBS detection agar bi-plate [6-8]皆可以很方便地分離GBS 。 Lim broth[5, 9]為含 colistin 及 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養液，可抑制革蘭氏 陰性桿菌的生長。也有研究報告顯示[11]，檢 體增菌後的GBS分離率優於未增菌者，原因 可能是抑制其他陰道/直腸菌群，但此增菌方 法須經過多次培養確認，將會延遲報告[10] 。 Trans-Vag broth[5, 11]為含5%綿羊血、 gentamicin 及 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養液 ，大致上與 Lim broth 相同只差使用 的抗生素種類不同與額外添加5%綿羊血。 Gentamicin 和nalidixic acid可抑制部分革蘭 氏陰性菌，添加5%綿羊血目的為提供更佳的 營養分以增加GBS的生長。 CMPTM Carrot broth[5, 12]為一種液態增 菌/鑑別培養基 ，含 GBS 生長所需物質及抑 制其它非鏈球菌的抗生素，並含少量瓊脂與 特殊養份促使 溶血型 GBS 顯色，陽性反應 會產生胡蘿蔔色。先前研究報告指出， -GBS 在Carrot broth產生胡蘿蔔色具有100%的專 一性[13]，因此產色即可發出陽性報告[3] ，可以減少再次移種所需的人力 、物力。 雖然GBS在BAP的生長菌落大多呈 溶 血型（菌落周圍完全溶血） ，但仍有約3-5% 的菌落呈 溶血型（不溶血）且在Carrot broth 中不顯色，為能夠確切檢測出所有GBS，可 搭配使用GBS detection agar，相關研究報告 指出CMPTM / GBS detection agar及 Hardy GBS DetectTM會誘導 溶血型GBS呈現 溶血 型 ，將可提高 溶血型 GBS 偵測的靈敏度與 分離率[14-15]。 本研究比較目前GBS檢測常用的三種增 菌培養液(Carrot broth, Lim broth 及 TransVag broth)的效能，除了測試此三種增增菌培 養液的偵測極限，也與三種常見產道棲息菌 混合接種，以了解GBS在偵測中可能受到的 干擾。
材料與方法
試驗菌株 本研究選用的測試菌株包括五株標準菌 種，Streptococcus agalactiae (ATCC 12386)、 Streptococcus agalactiae (ATCC13813)，Enterococcusfaecalis(ATCC29212) ，Staphylococcus aureus (ATCC 25923)與 Escherichia coli (ATCC 25922)。上述五種菌株皆保存在-70℃ 的 GermBank 菌種保存管（啟新生物科技公 司，新北市） ，試驗前取出接種在 BAP 於 35-37℃的CO2 培養箱培養18-24小時，共活 化兩次。
增菌培養液、移種培養基與試劑 本研究使用的增菌培養液包含 CMPTM Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth， 以及移種培養基BAP與 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar之 bi-plate和系列 稀釋使用的Tryptic soy broth (TSB) 培養液， 皆由啟新生物科技有限公司（新北市，台灣） 提供。
三種增菌培養液的偵測極限 分別將 與 -GBS用TSB調至McFarland no 0.5 (1.5×108 CFU/mL)，再進行10倍系 列稀釋至103-10 CFU/mL，並各取0.1 mL分 別接種在CMPTM Carrot broth、Lim broth及 Trans-Vag broth中（實際接種菌量為102-100 CFU），接種完後，置於35-37℃的 CO2 培 養箱培養，18-24小時後觀察每一增菌液的 顏色變化，再以四區及三區劃線分別移種於 BAP與CMPTM Carrot agar及 / GBS detection agar之bi-plate，並於35-37℃的CO2 培養箱 培養18-24小時，觀察菌落是否生長與是否 有胡蘿蔔色及溶血菌落的產生 。
三種增菌培養液的干擾試驗 依照上述實驗得到GBS在各增菌培養液 中的偵測極限，再分別將Enterococcus faecalis (ATCC 29212)，Staphylococcus aureus (ATCC 25923)與 Escherichia coli (ATCC 25922)利 用TSB調至相當於McFarland no 0.5標準液， 並進行十倍系列稀釋，將 與 -GBS固定菌量 104 CFU，和其餘三種干擾菌分別以10:1 、 1:1 、1:10之比例混合，然後都取0.1 mL 分 別接種於CMPTM Carrot broth、Lim broth及 Trans-Vag broth 中 ，接種完後置於35-37℃ 的 CO2 培養箱培養18-24小時，待增菌後觀 察每一增菌液的顏色變化，再以四區及三區 劃線分別移種於BAP與 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate，並於 35-37℃的CO2 培養箱培養18-24小時，觀察 菌落是否生長與是否有胡蘿蔔色及溶血菌落 的產生 。
結果 與 -GBS在三種增菌培養液的偵測極限 將 102-100 CFU的 與 -GBS分別接種在 Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth ， 並於35-37℃的CO2 培養箱培養18-24小時後觀察顏色變化，並接種在CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate，於 35-37℃的CO2 培養箱培養18-24小時後觀察 培養基上的菌落顏色及形態 。 -GBS ： -GBS 於 Carrot broth 中在菌 量高於10 CFU 時皆產生胡蘿蔔色 ，偵測率 皆為100% (3/3) ，不過若是菌量為1 CFU時 則沒有顯色，不過卻在 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar之 bi-plate中有其 中兩片產生胡蘿蔔色菌落，偵測率降低為 66.7% (2/3)；在 Lim broth 中 ，當菌量高於 10 CFU時 ，偵測率為100% (3/3) ，若是菌量 為 1 CFU時則降低為0% (0/3)；在Trans-Vag broth中，當菌量高於10 CFU時，偵測率為 100% (3/3)，若是菌量為1 CFU時則降低為 66.7% (2/3) 。（表1） -GBS： -GBS 於 Carrot broth 中在菌 量高於10 CFU時的偵測率皆為100% (3/3)， 不過若是菌量為1 CFU時則降低為33.3% (1/3)；在Lim broth中，當菌量高於10 CFU 時，偵測率為66.7% (2/3) ，若是菌量為1 CFU時則降低為0% (0/3)；在Trans-Vag broth 中，當菌量高於10 CFU時，偵測率為100% (3/3) ，若是菌量為1 CFU時則降低為33.3% (1/3)。（表1）
與 -GBS在三種增菌培養液的干擾試驗 本研究將Enterococcus faecalis，Staphylococcus aureus與Escherichia coli以 10:1、 1:1、1:10之比例分別與 與 -GBS 混合，並 接種在Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth 並於35-37℃的 CO2 培養箱培養18-24 小時後觀察顏色變化 ，並接種在CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate ， 並於35-37℃的CO2 培養箱培養18-24小時後 觀察培養基上的菌落顏色及形態 。 -GBS： -GBS 於 Carrot broth 中與其 他三種菌以三種比例混合培養後，其中，與S. aureus 與 E.coli 混合的三種比例皆100% (3/3)產生胡蘿蔔色，而與E. faecalis以 10:1 或是1:1混合也不會干擾到胡蘿蔔色產生， 不過若是 -GBS與E. faecalis以 1:10混合的 話則不產生胡蘿蔔色(0/3)，必需接種到CMP TM Carrot agar及 / GBS detection agar之 bi-plate後 ，才在其中一片培養基上發現胡蘿 蔔色的菌落(1/3)。此外， -GBS 於Lim broth 及Trans-Vag broth中與其他三種雜菌混合培 養之後，S. aureus與 E.coli也不會干擾到 GBS的偵測 ，偵測率為100% (3/3)，只有當 -GBS 與 E. faecalis 以 1:10混合才會影響到 其偵測的能力，偵測率分別為0% (0/3)及 66.7% (2/3)（表2）。 -GBS： -GBS 的實驗結果與 -GBS 相 似，在Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth 中，S. aureus 與 E.coli 並不會干擾 GBS的偵測 ，只有 -GBS與 E. faecalis以 1: 10混合才會影響到其偵測的能力 ，偵測率分 別為33.3% (1/3) 、0% (0/3)及 33.3% (1/3) （表2）。
討論
GBS常用的三種增菌培養液CMPTM Carrot broth, Lim broth及Trans-Vag broth ，在之前 的研究報告皆有指出可有效增加GBS生長， 有助於 GBS 在平板培養基上的分離率[4-5]。 此次研究比較三種增菌培養基的效能 ，結果 指出三種增菌培養液對於 -GBS都可以100% 偵測到10 CFU 以上的菌量，若是 -GBS 為 1 CFU 時 ，Carrot broth 及 Trans-Vag broth 依然有66.7%的偵測率 ，不過Lim broth則為 0%（表1）。先前研究指出 ，Carrot broth對 於 -GBS 具有100%產生胡蘿蔔色的專一性 [14]，而在本研究中觀察到當 -GBS菌量為10 CFU 以上時，Carrot broth 皆可產生典型胡 蘿蔔色 ，不過在菌量為1 CFU 時 ，Carrot broth卻不產色，需要移種至同樣能使 -GBS
產生胡蘿蔔色的平板培養基後，才能鑑定 出 -GBS ，這是由於當菌量過低時， -GBS 在 Carrot broth 內的分佈不集中，因此即使 產色也無法輕易用肉眼觀察，此時只能增長 培養時間或是移種到平板培養基進行二次增 菌才可以觀測到 -GBS。啟新生物科技公司 所研發的 CMPTM GBS TransCultSwab 也具 有產生胡蘿蔔色的能力，與 Carrot broth 不 同的地方在於CMPTM GBS本身即為採檢管 ， 在 35-37℃保存時能即時增菌 ，也因為其為 半固態培養基，更能讓檢體內的GBS即時增 菌以及維持厭氧的環境，因此在臨床上的應 用上比Carrot broth有更好的效能[16-19]。 對於 -GBS的偵測極限 ，Carrot broth及 Trans-Vag broth都可以100%的偵測到10 CFU 以上的菌量，若是菌量為1 CFU 時，只有 33.3%的偵測率。而Lim broth對於 -GBS的 偵測極限 ，當菌量為10 CFU時為66.7%，1 CFU時為0%，這可能是由於Lim broth中所 含的養分相對於其他兩種增菌培養液較低， 因此Lim broth對於低菌量的增菌效果較差。 將Enterococcus faecalis，Staphylococcus aureus 與 Escherichia coli 以 10:1、1:1、1: 10之比例分別與 與 -GBS混合進行GBS的 干擾試驗，經由三種增菌培養液培養後，結 果顯示S. aureus與E. coli在任何比例下，均 不影響 與 -GBS的生長，是由於三種增菌液 中皆有添加特定的抗生素來抑制革蘭氏陰性 菌，還有除了鏈球菌以外的革蘭氏陽性菌。 不過針對 E. faecalis，當 E. faecalis 的菌量 高於 與 -GBS 10倍以上時 ，就會干擾GBS 的生長（表2），也間接影響 -GBS在Carrot broth中的產色。 綜合上述研究結果，對GBS來說 ，CMP TM Carrot broth及 Trans-Vag broth 具有較相 近的增菌能力，而 Lim broth 相較於其他兩 種增菌液 ，增菌能力顯然地較為不足。其中 Carrot broth更具有產生胡蘿蔔色的效能，一旦產色即可判定為 -GBS，不需要再移種至 其他培養基，可以省下更多的人力 、物力以 及時效[16-18]。本次研究所用的三種增菌液接 對於臨床上的雜菌都具有一定的抑菌性 ，唯 一會造成影響的是 E. faecalis，不過由於 E. faecalis 在分類與結構上都與 GBS 相近 ，因 此目前難以在培養的階段專一性地抑制E. faecalis.
參考文獻 1. 社團法人台灣醫事檢驗學會。孕婦 B 群鏈球菌流行 病學、培養檢體處理及常在菌形態特性介紹。https:// www.labmed.org.tw/Upfiles/Test_5A/20177191587.pdf。 2017。 2. 衛生福利部國民健康署。孕產B群鏈球菌篩檢。https:/ /www.hpa.gov.tw/Pages/List.aspx?nodeid=196。2017。
