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前言
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 及其腸毒素可經由食品媒介引起腸胃炎 ，為 食物中毒的主要致病原之一[1, 2] 。中國大陸國 家標準金黃色葡萄球菌檢驗公告方法[3]建議 使用血瓊脂平板（BAP ，以TSA或Columbia agar為基礎培養基）作為分離培養基。另外， 臨床微生物檢驗室常用TSA所配製的BAP接 種臨床檢體[4] ，以便初步識別不同溶血型式的分離菌。
此兩種檢驗室之所以使用BAP ， 係因為可利用此菌在BAP的 溶血性( -hemolysis)作為生長菌落的識別[3, 4] ，BAP上菌落 的 溶血性係因為其中的紅血球被能夠產生溶 血素(hemolysin)的S. aureus所分解而破裂， 造成溶血現象，因此，菌落周圍將呈現環狀 透明[4]。 由於BAP配製所使用的基礎培養基因應 用對象不同而異 ，並且同種類菌不同菌株在 含有不同基礎培養基BAP的溶血能力是否相 同，將是臨床檢驗室或食品廠品管室檢驗人 員極欲了解的問題 ，目前 ，用於配製BAP的 基礎培養基種類包括 Tryptic Soy Agar-II
(TSA-II)、Columbia Agar、Brucella Agar以 及brain heart infusion agar (BHIA) ，配製後 倒平板前 ，再添加5~10%綿羊血 。其中 ，含 TSA-II的BAP用於培養一般常見的細菌及酵 母菌，含Columbia Agar的BAP用於培養嗜 氧性與兼性厭氧菌以及絕對厭氧菌 ，含Brucella Agar之BAP用於分離厭氧菌，而BHIA 則常用於分離真菌[5] 。 在檢驗室，不同鏈球菌常利用其生長菌 落在BAP呈現的溶血型做為菌種或不同血清 群的初步鑑定依據[6] ，一般 溶血型B群鏈球 菌(Group B streptococci，GBS)在 BAP的生 長菌落具有溶血性，但佔約3~5%的 溶血型 B 群鏈球菌卻無法在BAP呈現明顯溶血性[7, 8]，因此 ，需要含有溶血加強劑才能誘導不 溶血的 GBS 菌落產生 溶血，否則易導致其 漏檢[9]。由於臨床上S. aureus亦可能出現侏 儒變異株(dwarf variant)，其對營養需求較 高，在BAP上常形成微小的菌落，而且通常 不具 -溶血型[10, 11]。有鑑於此，本研究以添 加與不添加溶血加強液至含不同基礎培養基 (TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 與 BHIA)之BAP探討是否會對S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538溶血能力產生影響 。
材料與方法
菌株製備 本研究使用 S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538作為培養基生長效能測試的標準 菌株 ，菌株保存於-70℃ ，研究操作前，將上 述菌株移種至 BAP（啟新生物科技有限公 司 ，新北市） ，培養於35±1℃培養箱中18~24 小時 ，共接種兩次以活化菌株。之所以選擇 此兩種菌株做為研究對象，係因ATCC 25923 為臨床[4]以及中國大陸國標食品微生物學檢 驗 ：金黃色葡萄球菌檢驗建議的標準菌株[3]， 而 ATCC 6538則為美國藥典[12, 13]及中華藥 典[14, 15]之無菌試驗法及非無菌產品中之特定微生物檢驗法建議的標準菌株。S. aureus ATCC 25923菌落在BAP上的菌落顏色為白 色，形狀為圓形 、凸起典型菌落 ，而 ATCC 6538菌落顏色則為黃色，亦呈圓形 、凸起 ， 兩種菌株的菌落大小相近。
培養基 本研究使用的各種基礎培養基均添加5% 綿羊血而製成 BAP，基礎培養基包含：(i) TSA-II、TSA-II+（TSA與 TSA-II+分別代表 未添加及添加溶血加強液之BAP）；(ii) Columbia agar、Columbia agar+（Columbia agar 、 Columbia agar+分別代表未添加及添加溶血 加強液之BAP）；(iii) Brucella agar、Brucella agar+ (Brucella agar、Brucella agar+分別代 表未添加及添加溶血加強液之 BAP)；(iv) BHIA、BHIA+（BHIA與 BHIA+代表未添加 及添加溶血加強液之BAP），這些含有各種 基礎培養基的BAP均購自啟新生物科技有限 公司（新北市，台灣） 。
測試菌懸浮液的製備 首先將新鮮生長S. aureus兩種菌株的生 長菌落分別以接種環挑取，然後移種至5 mL Tryptic Soy Broth (TSB)中，懸浮液調整至相 當於McFarland No. 0.5的標準濃度，並以分 光光度機測量調整其optic density (O.D.)值至 0.08~0.1之間，此時菌數約為1.5×108 CFU/ mL，接著進行十倍序列稀釋5次至約103 CFU/ mL後，然後進行各種BAP的溶血試驗。
溶血性試驗 以微量吸管分別吸取兩種菌株的菌液0.1 mL 單獨地加至 TSA-II、TSA-II+ 、Columbia agar、Columbia agar+ 、Brucella agar、Brucella agar+ 、BHIA 與 BHIA+ 所配製的 BAP，再以 無菌玻棒均勻塗抹，操作二重複。將所有接 種的BAP倒置培養於35±1℃培養箱，24±2小時後觀察所有BAP上生長菌落大小 、溶血圈 大小 ，並進行菌落計數，然後比較未添加與 添加溶血加強液對兩菌株生長菌落溶血圈大 小的影響 。以游標尺測量5 個單一菌落溶血 圈大小(cm)後加以平均，且計算標準差。本 研究以TSA-II血平板溶血圈大小作為對照組 (100%)比較兩種菌株在各種BAP的溶血能力。
結果
測試 S. aureus ATCC 25923與 ATCC 6538兩菌株在各個BAP (TSA-II、TSA-II+ 、 Columbia agar 、Columbia agar+ 、Brucella agar、Brucella agar+、BHIA與 BHIA+)的菌 落數，選擇可計數的25~100 CFU 範圍 ，這 些BAP的平均菌落數落差都在30% 以內（圖 1） ，此指出兩菌株在各種 BAP 的生長效能 差別甚少[16]，且各個BAP上生長菌落的大小 相近 ，並不受基礎培養基的成分差異與溶血 加強液添加與否的影響 ，但溶血圈大小卻受 到菌株種類與基礎培養基成分的影響 。 ATCC 25923 在含 TSA-II，TSA-II+， Brucellla agar與 Brucella agar+ 的 BAP與對 照組TSA-II溶血圈大小相近 ，而Columbia+ 的溶血圈雖然大於Columbia者 ，但與對照組 TSA-II比較，還是較小。另外，結果指出此 菌株在BHIA+上生長菌落的溶血能力最差， 此指出加入溶血加強液，反而會抑制此測試 菌株的溶血能力 。（表1） ATCC 6538在含Columbia+與 Brucellla agar的 BAP與對照組含TSA-II的 BAP上生 長菌落的溶血圈大小無太大差異 ，然而 ，在 含 BHI與 BHI+者比含TSA-II的 BAP對照組 減少約25%，且溶血圈被抑制更為明顯 ，尤 其是添加溶血加強液者更為顯著。（表1）
討論
S. aureus因含有溶血素（ 、 、 、 毒 素）而可溶血紅血球，因此在BAP上的生長菌落具有完全( -)溶血性質，此特性可作為 初步鑑別此菌的依據之一[3, 4] ，因此，BAP 上生長菌落所顯現的溶血性直接影響檢驗人 員的判讀，由於S. aureus為臨床感染及食品 中毒常見的病原菌之一，因此，更需要依據 溶血圈作為初步鑑別。台灣衛福部食藥署食 品金黃色葡萄球菌之檢驗 ，只建議使用BP培 養基(Baird-Parker medium)平板[17] ，而中國 大陸國標方法則建議使用BAP 與 BP平板作 為初步分離食品檢體中的S. aureus[3]。 本研究計算BAP上生長菌落溶血圈大小 時 ，皆選擇菌落數25~100 CFU/平板的單一 菌落作為量測目標，此係為了避免生長菌落 過多，溶血圈互相干擾而影響其等的量測。 從 BAP 的基礎培養基成分分析， TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar都含有胰消化 蛋白腖(pancreatic digest of casein)作為氮素 源 ，氯化鈉作為細菌生長環境酸鹼變化的緩 衝劑，並維持滲透壓 。其中，TSA-II額外添 加生長因子，Columbia agar添加牛浸心液與 玉米澱粉 ，而Brucella agar則含有亞硫酸氫 鈉[5]。S. aureus雖然可在含BHI成分的BAP 上生長，但其溶血能力不佳，研究結果發現 測試的兩種菌株在含BHIA與 BHIA+的 BAP 上溶血圈的大小都會下降，尤其是添加溶血 加強液者反而更會被抑制。另外，ATCC 6538 於添加溶血加強液之Columbia agar+ 上所出 現的溶血圈雖然比未添加者大些，但並不顯 著。 雖然S. aureus有些菌株生長菌落的外觀 屬於侏儒變異株(dwarf variants) ，通常菌落 微小，不產生溶血[9, 10] ，是否可藉由溶血加 強液的添加至BAP加以識別，值得未來加以 探討 。 綜合上述，吾等認為(i) 含TSA-II、Columbia agar 、Brucella agar基礎培養基的BAP 均可提供S. aureus生長菌落之明顯 -溶血性 而有助於其鑑別。(ii) 添加溶血加強液對 S.aureus 生長菌落之溶血圈大小與未添加者間 並無差異。(iii) 以 BHIA與 BHIA+基礎培養 基所配製的 BAP 不適用於 S. aureus 生長菌 落之鑑別 ，添加溶血加強液甚至會抑制此菌的溶血能力 ，因此，無論在食品或臨床檢驗 上，只需用以 TSA-II、Columbia agar、 Brucella agar基礎成分培養基配製的BAP進 行 S. aureus的分離及鑑別 。
